Ferdinando II subentrò come Granduca di Toscana al padre Cosimo II nel 1621, a soli undici anni. Il potere effettivo fu esercitato, fino alla maggiore età, da una reggenza di cui facevano parte la madre Maria Maddalena d'Austria (1589-1631) e la nonna Cristina di Lorena (1565-1636).
Ferdinando, come i suoi predecessori, attuò una politica di equilibrio con le grandi potenze; unica eccezione fu lo scontro con lo Stato Pontificio. Negli anni Trenta a mettere in urto gli opposti interessi fu il Ducato di Urbino su cui il Granduca avanzava diritti a causa del suo matrimonio con Vittoria della Rovere, erede dell'ultimo Duca di Urbino. Questo scontro con papa Urbano VIII va tenuto presente anche per meglio comprendere le difficoltà che Ferdinando incontrò nel difendere Galileo, quando questi cadde in disgrazia presso il pontefice. I dissapori con Urbano VIII non cessarono neanche in seguito; andarono, anzi, ad acuirsi negli anni Quaranta, per il tentativo del papa di togliere ai Farnese il Ducato di Parma. L'ingerenza portò Ferdinando II a formare una lega con Venezia e Modena e a scontrarsi col pontefice nella guerra di Castro, che non ebbe né vincitori né vinti.
Nel governo Ferdinando II fu coadiuvato dai fratelli, cui fu sempre molto legato, e ai quali delegò parte dei compiti: Mattias si occupava degli affari militari, Giovan Carlo delle finanze, Leopoldo di alcune questioni politiche. Si dimostrò un buon sovrano, in particolare nei momenti di pericolo, come negli anni della peste del 1629-1631: oltre a promulgare importanti leggi di salute pubblica, egli stesso era solito girare per la città, mostrandosi fra la gente per aiutarla e incoraggiarla.
Al nome di Ferdinando II sono legate le vicende del processo a Galileo, celebrato nel 1633 e terminato con la condanna e l'abiura dello. Il Granduca era stato discepolo e protettore di Galileo e, pur non potendo opporsi alla richieste del Sant'Uffizio - va ricordato che all'epoca aveva solo 22 anni - cercò comunque di alleggerirlo il più possibile durante i mesi del soggiorno forzato a Roma. Mise a sua disposizione la lettiga che lo condusse nella capitale pontificia e l'alloggio presso la residenza dell'ambasciatore toscano. Arrivò fra i primi a trovarlo nel suo soggiorno obbligato a Siena e, anche in seguito al suo ritorno a Firenze, dimostrò di tenerlo in grande stima recandosi spesso in visita presso la Villa di Arcetri, nella quale Galileo era stato confinato.
Negli anni precedenti il processo Ferdinando II aveva dato ampio credito al proprio Primario matematico e filosofo. In più di un'occasione lo aveva consultato perché desse il proprio parere riguardo a opere ingegneristiche di grande rilievo: ne sono esempio le perizie redatte circa la sistemazione del fiume Bisenzio, per contenerne le continue tracimazioni, o circa il progetto di rendere l'Arno navigabile, impresa che apparve a Galileo "faraonica". Scrisse a questo proposito nella propria analisi: "quando si potessero mettere al lavoro, come potettero in fabriche immense antichi signori di regni amplissimi, centinaia di migliaia di schiavi, io non ci penserei punto di mettermi all'impresa e ne spererei felice esito" ( Ed. Naz. vol. VI, p. 653 ). Non mancarono richieste di pareri circa alcuni progetti per la realizzazione della facciata del Duomo.
Con Ferdinando e la sua Corte Galileo intrattenne rapporti molto stretti, più che con tutti i predecessori, principalmente grazie alla posizione di prestigio ormai consolidatasi negli anni e in secondo luogo perché gli interessi culturali del Granduca erano profondamente in sintonia con quelli dell'antico maestro.
Ferdinando è ricordato dai contemporanei come uomo di cultura e di scienza. A Palazzo Pitti condusse personalmente attività di ricerca nella sua "Accademia medicea sperimentale". Migliorò il termoscopio ideato da Galileo aggiungendovi delle scale, si dilettò di meteorologia partecipando a esperienze di misurazione dell'umidità dell'aria attraverso igrometri a condensazione, sperimentò una sorta di incubatrice artificiale per far nascere i pulcini nella serra degli agrumi del Giardino di Boboli, grazie ai nuovi termometri, alla messa a punto dei quali aveva collaborato. Sostenne incondizionatamente le attività del medico Francesco Redi e ne condivise gli interessi.
Nel 1657, su iniziativa del fratello Leopoldo e sua, nacque l'Accademia del Cimento, progetto culturale, ma anche politico. I Medici, infatti, avevano investito per più di vent'anni su Galileo e l'Accademia si presentò come un modo per far risaltare il nuovo metodo sperimentale, non direttamente colpito dall'abiura, in un'ottica, però, conciliazionista e non antagonista alle teorie aristoteliche sostenute dalla Chiesa, e a scapito maggior portato rivoluzionario della filosofia di Galileo, l'idea cioè dell'interpretazione dei fenomeni naturali in base a leggi matematiche e geometriche. L'operazione si rivelò difficile e alla fine ineficace: l'anima moderata e quella radicale dell'Accademia arrivarono allo scontro, con la perdita di personaggi di spicco come Giovanni Alfonso Borelli, che abbandonò i lavori comuni con barometri, termometri, igrometri, bilancette idrostatiche, liquidi esposti al gelo e metalli al calore, per dedicarsi unicamente agli studi anatomici. Dopo dieci anni l'Accademia fu sciolta, senza mai aver preso posizione sulle cause dei fenomeni, così meticolosamente catalogati e accuratamente descritti nei Saggi di naturali esperienze (Firenze, 1667), l'unica opera prodotta dal variegato consesso di dotti.